멸균 공정에 대한 전반적인 validation 접근 방법 및 예시에 대하여 이어서 이야기 할 것이다.
[Microbiology of Sterilization]
이번에는 미생물학적 관점으로 Steam Sterilizer에 대하여 이야기 해 보도록 하겠다.
미생물학적 관점으로 보았을 때, Death Kinetics를 먼저 이해해야 하며, Steam sterilizer는 아래의 항목에 따른 확률함수이다. (절대 무균은 확인 할 수 없음)
Number of challenge organisms
Heat resistance of challenge organisms
Amount of heat exposure (time at temperature)
이는 D, Z 및 F value를 이용하여 멸균주기 및 효과를 판단할 수 있으며, 먼저 각각의 value에 대하여 이야기 해 보겠다.
D, Z, F value는 이전 글에도 한번 다룬 적이 있으며, 함께 본다면 도움이 될 것이다
D value:
생균수가 1 log cycle 만큼 감소하는데 걸리는 시간은 생균의 90%가 사멸하는데 걸리는 시간, 즉 생균수가 1/10로 감소하는데 걸리는 시간에 해당하므로 이를 "Decimal Reduction Time" 이라 하며, 일반적으로 D값 (D-value)이라 부른다. D값은 미생물의 사멸속도 또는 내열성을 표시하는 특정 값으로 미생물의 종류와 환경요인에 따라 다르다. 일반적으로 미생물의 D값은 초기 균수에는 무관하나 온도의 영향을 받기 때문에 어느 온도에서의 D값이란 것을 나타내기 위하여 가열온도 T를 아래첨자로 Dt와 같이 표시하며, 일반적으로 D value의 기준은 아래와 같다.
D121 – values of 내열성 박테리아(heat resistant bacterial) spores are > 1.0 min.
D121 – values of typical 식물성 유기체 (vegetative organisms) are < 0.5 min.
Z value:
미생물의 열 사멸을 간편하게 표현하기 위하여 사용하는 또 다른 상수는 Z-Value이다. Z-Value는 D-Value를 10분의 1로 줄이는데 필요한 온도의 변화량이다. Z-Value도 미생물의 고유 특성이다. 단위는 온도와 같은 ℃ 또는 ℉이다.
Z-Value가 작은 Reaction은 멸균 시간을 줄이려 할 때 작은 온도 변화에 큰 영향이 있고, Z-Value가 큰 Reaction은 멸균 시간을 줄이기 위해 온도 변화를 크게 줘야 한다는 뜻이다.
일반적으로 포자생성 박테리아는 약 10℃의 Z-Value를 갖는다. 열이 가해진 화학 반응으로 만들어진 물질은 미생물보다 훨씬 큰 Z-Value를 갖는다. 이를 응용하면 낮은 Z-Value를 갖는 병원체 (Pathogen) 보다 비타민 같은 영양소들이 큰 Z-Value를 갖기 때문에, 높은 온도에서 짧은 시간 동안 멸균하면 병원체는 파괴되고 영양분은 파괴되지 않는 구간이 발생하므로 고온순간멸균(HTST: High Temperature Short Time)과 같은 멸균 전략을 사용 할 수 있다.
일반적인 Z value는 아래와 같다.
Z values of heat resistance bacterial spores are typically 8 –12℃
Z values of 10℃ is usually assumed for steam
F value:
일정한 온도에서 멸균 지표 미생물을 실질적으로 사멸시키는데 요하는 가열시간(단위: 분)을 Thermal Death Time(가열치사시간)으로 정의하고, F로 표기한다. 멸균공정에서 가열치사시간은 주어진 온도에서 시료에 존재하는 미생물을 완전히 사멸시키는데 필요한 시간이 아니라 소비자의 위생과 저장 조건에서의 변질 속도를 고려하여 안전한 최종 농도까지 멸균하는데 필요한 시간이라는 의미이다. (Lethal rate)
F value (Lethal rete) = 121.1℃ 온도에서 Z value 10 ℃ 를 사용하여 계산된 제품 용기 또는 유닛에 전달된 증기 멸균의 등가이다.
Δt = time interval between the measurement of T
To = measured temperature of the sterilized product at time T
Tb = reference temperature = 121.1 ℃ for steam
Z = assumed Z value for steam = 10 ℃
우리는 제공된 정보를 통하여 다른 방법으로 F value를 도출 할 수 있으며, 이에 대한 식은 아래와 같다.
D121 = D value at 121℃ of the bioburden
A = bioburden per container
B = maximum acceptable sterility assurance level
관련된 예제를 한번 풀어보면 도움이 될 것이다.
e.g.) 멸균 중인 제품은 용기당 미생물 1,000개의 바이오버든이 존재하고, 미생물의 D value는 2min, 우리가 목적하는 무균보증수준은 10-6이다.
F value는 18이 되어야 한다.
우리는 무균에 대하여 이야기 할 때, SAL 이란 것을 자주 이야기 한다.
SAL은 Sterility Assurance Level로 멸균 보증 수준을 이야기 하며, 미생물의 생존 가능성을 말한다.
Probability of a nonsterile unit(PNSU)의 확률은 열에 노출(계산된 F0)과 초기 유기체의 수를 기준으로 계산할 수 있다.
이 때, 초기 미생물의 부하가 106개의 내열성 유기체(D value: 1.0min)로 가정하여 F0 = 12를 만족하는 멸균 사이클에 오염된 Unit의 1/1,000,000 확률이다. 이것은 “Overkill“ 멸균이라고 이야기 한다.
멸균 방법의 경우 크게 Overkill approach와 Bioburden approach로 나뉘는데, 이는 뒤에서 상세히 설명하는 것으로 하며, 전에 관련된 글을 작성한 것이 있으므로 이를 참조하면 좋을 것이다.
미생물학적 관점에서 멸균의 적절성을 주로 BI를 통해서 확인하고 있으며, BI는 Biological Indicator로 멸균 주기의 효과에 사용되는 미생물의 특정 종(일반적으로 내열성 포자)을 Loading하여 멸균의 적절성을 확인 한다.
이 때, Steam Sterilization에 사용하는 것은 Geobacillus stearothermophilus(ATCC(The Global Bioresource Center)# 7953으로 분류된 Bacillus stearothermophilus 라는 균주가 106개의 포자를 포함하고 D121 value가 1.0min 이상인 것을 가장 많이 사용한다. (멸균 대상 및 목적에 따라 D value가 다른 것을 사용 할 수도 있다.)
Bi(Biological Indicators는 3가지 Type이 존재하며, 각 사용 목적에 따라 USP<1035> Biological Indicators for Sterilization를 참조하여 선택하여 사용 할 수 있다.
파우치 내부에의 종이 Strip에 말린 포자를 접종한 것으로 가장 보편화되어 사용 된다.
밀폐된 앰플의 배지에 포자가 현탁되어 있는 것으로 손쉬운 취급이 장점이다.
제품 또는 성분의 직접 접촉을 위한 건조된 포자이며, 잘 사용하지 않는다.
이 글에서는 미생물학적 관점으로 Steam Sterilizer에 대하여 이야기 해 보았다.
다음 글에서는 멸균 사이클의 개발 (Sterilization Cycle Development)에 대하여 이야기 해 보도록 하겠다.